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内蒙环保管家告诉你什么是脊髓灰质炎病毒杀灭试验?

2021-10-15

  脊髓灰质炎病毒杀灭试验的主要目的是测量消毒剂灭活脊髓灰质炎病毒(Poliovirus、PV)所需的剂量,以验证病毒污染物消毒的实际剂量。内蒙环保管家对脊髓灰质炎病毒杀灭试验的试验原理是用细胞感染法测量消毒剂作用前后(或实验组和对照组)样本中脊髓灰质炎的量,以细胞病变为判断指标,确定每组病毒的感染滴度,计算消毒剂对脊髓灰质炎的灭活率。


  脊髓灰质炎病毒杀灭试验分组。


  1)测试组。根据被测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量的估计,设置合适的浓度和作用时间组(不少于1浓度和3作用时间),作用时间的设计不得少于30s。


  2)阳性对照组。用去离子水代替消毒剂,按照试验组规定的步骤加入脊髓灰质炎悬液进行试验培养,观察脊髓灰质炎生长是否良好。


  3)阴性对照组。以不含脊髓灰质炎的完全培养基作为阴性对比,观察所用培养基是否污染,细胞是否生长良好。


内蒙环保管家


  脊髓灰质炎悬液定量灭活试验的操作程序。


  1)从液氮中取出冷冻试验宿主细胞,在37℃温水中迅速融化,用细胞维持液洗涤两次后,转移到10毫升完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况,用于消毒试验。


  2)取出低温冷冻脊髓灰质炎-1毒株,37℃水浴融化,用细胞维持液稀释10倍,然后接种到含有单层细胞的细胞瓶中,放入37℃温箱中,与细胞吸附生长。每天观察病变,当3/4细胞发生病变时,收获病毒。收获时,取出培养液,用超声波或反复冻融破碎宿主细胞,尽快离心,将含病毒的上清液按每管1.Oml分装在无菌离心管(1.5ml)中,冷冻保存在-80℃备用。


  3)取待测消毒剂,用灭菌硬水稀释至所需浓度的1.25倍,备用于20℃±1℃水浴。


  4)取100μ1有机干扰物与100μ1病毒原液混合,在20℃+1℃水浴中作用5min,加入0.8ml待检消毒剂,立即混合并记。在规定的时间内,立即取出0.1ml,加入中和剂混合;或采用合格的除药方法。


  5)在阳性(病毒)对照组试验中,用无菌去离子水代替消毒剂。


  6)每组分别测量病毒滴度,可采用终点稀释法或噬斑法。


  7)试验重复三次。


  8)终点稀释法的操作步骤:首先用细胞维持培养液对滴定样本进行10倍系列稀释,然后在96孔培养板上滴定每个稀释样本中残留的病毒量,每个稀释度为4孔(每个孔应长满单层宿主细胞),37℃放置1h~2h,确保残留病毒全部吸附在细胞上。取出培养板,更换细胞维持培养液。继续放入二氧化碳培养箱(37℃,5%CO),在显微镜下逐日观察细胞病变,连续观察3d,逐孔观察记录细胞病变。终点稀释病毒感染滴度的计算:表示半数细胞感染剂量。


  9)噬斑法的操作步骤:首先用细胞维持培养液稀释滴定样本10倍,然后接种到细胞培养瓶中,滴定每个稀释样本中残留的病毒量。在接种细胞之前,将生长致密的单层细胞中的培养液倾出,加入1ml待测样品,放置37℃吸符1h~2h,倾出样液,加入含有0.8%琼脂的细胞维持液3m1,冷却后翻转细胞瓶,放置37℃培养48h~72h。然后每瓶细胞加入2m1甲醛溶液固定几分钟,用自来水冲洗,用结晶紫溶液染色几分钟,冲洗后计数。细胞瓶内圆形不着色的透明区域为蚀斑单位,计算每毫升样品中的病毒含量:pfu/m1=平板平均蚀斑×稀释倍数。为便于计数,病毒蚀斑一般控制在每个细胞瓶10pfu~30pfu。


  计算脊髓灰质炎病毒杀灭试验。


  灭活对平均值按以下类型计算阳性(病毒)对照组平均病毒感染滴度为No,实验(消毒)组平均病毒感染滴度为Nx。


  平均灭活值=logNo-logNx。


  脊髓灰质炎病毒杀灭试验的评价规定。


  1)脊灰病毒灭活试验可用于评估器械、餐具、物体表面和皮肤用化学消毒剂对病毒的灭活效果。病毒灭活滴度应达到4个对数值。


  2)正常情况下,3次试验的平均灭活对值≥4.00,可判定为对脊髓灰质炎病毒污染物进行消毒的实验室试验。同时,阳性对照组病毒滴度对数值应在5~7之间。


  脊髓灰质炎病毒杀灭试验注意事项。


  1)操作人员应具备基本的病毒学实验经验,尽量使用移液器和无菌一次性吸头。


  2)在杀菌试验中,每次应设置阳性对照。


  3)使用病毒载体进行试验的,可参照上述悬液定量试验程序,并按照病毒学原理进行适当修改。


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